碧芯生物的成長之路——矢志不渝推進(jìn)流式熒光檢測技術(shù)國產(chǎn)化

流式熒光檢測技術(shù)又叫液相懸浮芯片技術(shù)，自誕生以來，由于其靈敏而準(zhǔn)確的光學(xué)編碼鑒別、快速的反應(yīng)動力學(xué)、靈活的檢測項(xiàng)目組合、可實(shí)現(xiàn)定量分析以及同時適用于蛋白與核酸分子檢測等特點(diǎn)而成為理想的多重指標(biāo)聯(lián)合檢測的技術(shù)平臺。

利用液相懸浮芯片技術(shù)高通量檢測抗原的原理如圖1所示，在特定熒光編碼的微球上分別連接對應(yīng)的能特異性捕獲抗原的抗體用于捕獲溶液中的抗原。當(dāng)檢測樣品中存在這些抗原時，這些連接在熒光編碼微球表面的捕獲抗體將會與其結(jié)合，最后通過加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的特異性檢測抗體，形成微球連接的捕獲抗體-抗原-PE標(biāo)記的檢測抗體復(fù)合物。在流式細(xì)胞儀藻藍(lán)蛋白（APC）和藻藍(lán)蛋白-Cy7（APC-Cy7）通道下，微球被識別并用于判定檢測何種抗原；在流式細(xì)胞儀PE通道下，微球體上PE的熒光強(qiáng)度與樣本中各被檢測物的濃度呈正相關(guān)，各校準(zhǔn)品與其對應(yīng)的熒光信號可擬合成濃度—熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線方程可計算出各抗原的濃度。熒光編碼微球制備技術(shù)是流式熒光法的核心，然而這項(xiàng)技術(shù)由于技術(shù)門檻高，國內(nèi)該領(lǐng)域技術(shù)薄弱，一直被外國公司“卡脖子"（圖2為國外兩大基于懸浮芯片檢測的產(chǎn)品）。

圖1流式熒光法高通量檢測細(xì)胞因子原理示意圖（以6細(xì)胞因子檢測為例）。

圖2進(jìn)口兩大基于懸浮芯片的檢測產(chǎn)品

2012年，一位做生物材料的博士和另一位做生物檢測的博士一碰頭，于是誕生了做國產(chǎn)化懸浮芯片的念頭。十年過去，這小小的念頭就像一顆種子，一步步生根，發(fā)芽，茁壯成長，成為了現(xiàn)在的專業(yè)做磁性熒光編碼微球和高通量蛋白及核酸檢測的碧芯生物科技。

圖3碧芯生物科技Beadstar-mPlex^TM系列產(chǎn)品發(fā)展史

在不斷的技術(shù)研發(fā)中，我們摸索出了一套自己的技術(shù)，制備出了各方面性能不亞于進(jìn)口微球的Beadstar-mPlex^TM系列磁性熒光編碼微球，實(shí)現(xiàn)了單一粒徑編碼近60種（圖4所示）、兩種粒徑編碼超過100種的磁性熒光編碼微球，這個編碼重數(shù)雖不及頂尖進(jìn)口公司那么多，但也足夠滿足目前的臨床和科研使用需求了。在深入的研究中，我們發(fā)現(xiàn)微球與熒光抗體的非特異性吸附會產(chǎn)生一定程度的噪音（指在檢測中當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時微球在PE通道的熒光值減去微球本底熒光值）。當(dāng)噪音較高時會嚴(yán)重影響檢測的靈敏度并使得一些低值樣本在檢測中出現(xiàn)偏差，然而直至今日，這個問題并沒有引起同行的足夠關(guān)注。基于此，我們把關(guān)注點(diǎn)放在如何有效降低微球與熒光檢測蛋白的非特異性吸附上，經(jīng)過一系列艱難而又持久的摸索，我們最終采用優(yōu)化的配方來降低磁性熒光編碼微球表面對熒光檢測抗體的非異性吸附，這種低吸附的性能使得我們的微球在開發(fā)的相關(guān)下游產(chǎn)品中具有比進(jìn)口同類產(chǎn)品更高的檢出率。

圖4單一粒徑的60種磁性熒光編碼微球

在磁性熒光編碼微球的不斷優(yōu)化的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步開發(fā)了基于低吸附熒光編碼微球的下游產(chǎn)品—Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒（包括人類12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒以及小鼠10因子聯(lián)檢試劑盒）。以人類12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒為例，可在單個 25 µL 血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他體液樣品中同時定量檢測IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IFN-α2的濃度。與進(jìn)行傳統(tǒng)的夾心ELISA相比，基Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒可以在同等時間內(nèi)使用明顯更少的樣品分析多達(dá) 12倍的分析物。與進(jìn)口同類試劑相比，Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測試劑盒不僅有與之媲美的線性范圍（圖5）、靈敏度、重復(fù)性，還兼具低吸附磁性熒光編碼微球優(yōu)勢——低噪音。

圖5碧芯生物Beadstar-mPlex^TM12細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（5 parameter logistic fitting, R²均不小于0.99）；

在實(shí)際檢測中，由于正常人的血清中細(xì)胞因子濃度較低，目前大部分試劑對正常人血清中各細(xì)胞因子的檢出率不高（幾大主流國際品牌對正常人血清細(xì)胞因子檢出率不足50%）。究其原因，主要是熒光編碼微球?qū)晒鈾z測抗體的非特異吸附較強(qiáng)，導(dǎo)致噪音較高。如圖6所示，當(dāng)檢測低值血清樣本中，血清中存在復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，不可避免這些蛋白質(zhì)同樣會與微球產(chǎn)生非特異性吸附，從而與熒光檢測抗體競爭非特異性吸附位點(diǎn)，使最終的熒光檢測值并不能正確反映體系中細(xì)胞因子的濃度，甚至出現(xiàn)熒光值小于標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時的值，無法計算細(xì)胞因子的濃度。因此減少熒光編碼微球?qū)晒鈾z測抗體的非特異性吸附可顯著提升低值血清樣本檢測的準(zhǔn)確性、提升檢出率。碧芯生物Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測試劑盒采用的磁性熒光編碼微球通過自主研發(fā)的配方，讓我們的磁性熒光編碼微球具有更低的非特異性吸附，可顯著減少噪音（圖7）。實(shí)際血清樣本的結(jié)果也證實(shí)，碧芯生物的Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測試劑盒的檢出率要優(yōu)于進(jìn)口細(xì)胞因子聯(lián)檢試劑盒。

圖6非特異性吸附導(dǎo)致血清樣本檢測率低的原理示意圖

                                       圖7碧芯生物Beadstar-mPlex^TM與國外同類試劑的噪音對比

一路走來，碧芯生物始終堅定不移的以“建立民族品牌，推進(jìn)進(jìn)口試劑國產(chǎn)化進(jìn)程"為己任，力爭成為生命科技領(lǐng)域具有國際影響力的公司，為人類的健康事業(yè)做出貢獻(xiàn)。